Pour rappel, la lumière est un phénomène électrique et magnétique.

La limite de résolution d'un microscope de l'ordre :

• \(\lambda\) en profondeur '.
• \(\frac{\lambda}{2}\) lateralement.

Note

Les objets inférieurs à la limite de résolution ont un signal égal à la limite de diffraction.

Note

Le verre et l'huile ont un indice de diffraction proche.

Polariser filtrer une lumière en fonction de l'angle d'incidence des ondes.

Microscope est un appareil composé :

• d'un objectif.
• d'un oculaire qui sert à corriger les aberrations.

Les aberrations sont dû a des difference d'angles de diffraction qui varit en fonction de la fréquence des ondes lumineuses lors d'un changement de milieu. C'est le phénomène de diffraction.

Diffraction phénomène d'étalement de la lumière.

Ouverture numérique l'angle d'écart et la quantité de réfraction.

L'indice de réfraction est une mesure l'atténuation de la vitesse de l'onde dans le milieu. Lorsque l'onde entre dans un milieu est plus dense alors son traget se rapproche de la normale.

Note

L'indice de diffraction dépend de la longueur d'onde.

La microscopie : - basse résolution jusqu'à 120nm. - haute résolution de 50nm à 20nm.

La dispersion dépend de l'indice de réfraction du milieu. Caractérise la dispersion et la vitesse de lumière dans le milieu.

Note

Les tissus biologiques sont peu absorbants mais les irrégularités présentes à la surface vont créer un halot.

Champs sombre et contraste de phase

Le diaphragme d'ouverture et de champs servent à modifier la quantité de lumiere qui entre dans le système.

Il est possible de distinguer deux types d'améliorations pour augmenter la resolution ou le contraste de l'image en :

• en filtrant les photons recus.
• modifiant la qualité de la lumiere (feuille de lumiere).

Note

L'infrarouge pénètre mieux les tissus (phénomène de diffusion plus faible).

Filtrer les photons

• le contraste de phase consiste à assentuer le contraste de l'échantillon. Il permet d'augmenter les differences les dephasages entre photons en créant des interférences destructive avec la lumière qui n'a pas interagit et constructive le reste. Cette mehtode necessite l'utilisation de polariseurs.
• avec anneau de lumière
• confocal. Le av c dz multiple pineho'es Spinning disk.

Avec fluorescence

Microscopie a fluorescence à champ large

Réponse au problème d'une nombre trop faible d'émission de fluorochromes.

Eclair et capte la lumière sur une épaisseur de l'échantillons.

Déconvolution pour rendre l'image net. Traitement numérique. graduelle.

• quenching extinction reversible ou irreverisble de la fluorescence du a des interactions physiques avec leur environement.
• photoblanchiment (bleaching) perte irreversible de la faculté d'une molécule à être fluorescente. Elle se produit pour donner suite à l'oxydation.

Technique Utilise le bleaching Utilise le quenching Objectif principal FRAP Oui Non Étude de mobilité FLIP Oui Non Connectivité cellulaire FRET Non Oui Interaction moléculaire PAINT Oui (indirectement) Par effet d’échange Super-résolution STED Oui (contrôlé) Oui (émission stimulée) Super-résolution TIRF Réduction du bleaching Non Observation proche membrane

Utilisé pour suivre la cinétique en créant une zone bleacher comme référence.

La fluorescence permet de diminuer la résolution théoriquement à 10nm (généralement 40nm).

Microscopie moléculaire :

• Multi photonique Pour améliorer la pénétration dans les tissus, il faut utiliser des longueurs onde grandes (rouge) mais souvent pas suffisamment énergétique pour exciter le fluorochrome. L'idée est d'envoyer deux photons qui se retrouve sur un même point d'espace.
• Spectrale spectre d'un fluorochrome d'émission adjoint à une protéine.
• dynamique
• FRAP : il permet de mesurer la vitesse de diffusion dans une région d'intérêt. La région d'intérêt est éteinte (bleaching) puis on observe la vitesse de repeuplement. Cela permet également de déterminer la fraction mobile et immobile en comparant le signal avec l'image avec le bleaching.
• Intéraction moléculaire :
• FRET l'émission de fluorescence se fait par l'intération entre deux molécules. Elle dépend de la distance et de l'orientation des molécules entre elles.
• FSC évolution de l'intensité de la fluorescence dans une zone d'intérêt.
• FLIM (Life Time Imaging Microscopy) durée de fluorescence du donneur. Plus vite élément dans l'environnement = alors fret. Indépendance des concentrations des fluorochromes et .
• localisation :
• PALM/STORM faire clignoter les molécules aléatoirement puis de reconstruire l'image après avoir reconstruit le centre de chaque point càd éliminer la tâche d'Aery.
• STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy) le principe est d'éteindre la zone autour d'un point d'intérêt avec un laser (donus).

Note

La microscopie à extension consiste à agrandir l'échantillon pour augmenter la résolution.

Note

Le laser pulsé permet d'illuminer précisément temporellement un échantillon.

Microscopie cellulaire :

• multi photoniques : le fluorochrome est excité avec deux photons. Un des avantages de cette méthode est que l'on obtient un point focal, seul une toute petite zone est illuminée.

Note

En biologie, les longueurs d'onde utilisées pour la multi photonique sont comprise en 700-1300nm.

• à feuille de lumière (SPIM). La lumière d'excitation est focalisée sur un plan et l'objectif est situé perpendiculairement à ce dernier.

Note

Les caractéristiques de la feuille détermine la qualité de l'image.

FLIM spectrale permet de séparer les fluorochromes avec le même spectre d'émission par leur temps de vie.

Note

STED-FLIM est une méthode avec un laser dye (donuts) de faible intensité mais la segmentation se fait avec les temps de vie.

Fluorescence

• Luminescence par l'excitation des électrons d'un atome. On parle de fluorescence si le temps de démission d'un nouveau photon est « instantané » et sinon de phosphorescence.
• Incandescence par la chaleur (agitation thermique).
• Électroluminescence par le passage d'un courant d'électrons.
• Radioluminescence.
• Chimiluminescence lorsque le photon est produit au cours d'une réaction chimique (dont la bioluminescence de la luciférase).

De nombreux paramètre influence le rendement et l'efficacité du fluorochrome (polarité, ph, ions, liaison OH, pression, viscosité, T°, inhibiteurs, potentiel électrique).

Polarité un solvant faiblement polaire à tendance à diminuer la longueur d'onde d'émission.

En augmentant la viscosité, on limite la dégradation du fluorochrome.

Fonction d'étalement du point correction informatique.

Confocal illumination de l'échantillon par laser. Précision de la zone éclairée. Modifie la façon dont l'échantillon est éclairé.

Déterminer la bonne dimension d'une image pour limiter la perte de donner lorsqu'il y a une conversion en binaire (enregistrer en format informatique).

L'idée est de

Résolution x grossissement

Résolution maximale au double de celle du système d'acquisition.