Note

L'infrarouge pénètre mieux les tissus (phénomène de diffusion plus faible).

• confocal ouverture au niveau de l'optique qui obstrue les rayons qui ne sont pas dans le champs. Par exemple, les microscopes a spinningdisk possèdent un disques avec de nombreuses petites ouvertures.

Microscopie à fluorescence

La fluorescence permet de diminuer la résolution théoriquement à 10nm (généralement 40nm).

Microscopie moléculaire :

• dynamique
• FRAP : il permet de mesurer la vitesse de diffusion dans une région d'intérêt. La région d'intérêt est éteinte (bleaching) puis on observe la vitesse de repeuplement. Cela permet également de déterminer la fraction mobile et immobile en comparant le signal avec l'image avec le bleaching.
• Intéraction moléculaire :
• FRET l'émission de fluorescence se fait par l'interation entre deux molécules. Elle dépend de la distance entre elles.
• FSC évolution de l'intensité de la fluorescence dans une zone d'intérêt.
• localisation :
• PALM/STORM faire clignoter les molécules aléatoirement puis de reconstruire l'image après avoir reconstuit le centre de chaque point càd éliminer la tâche d'Aery.
• STED Le principe est d'éteindre la zone autour d'un point d'intérêt avec un laser (donus).

Note

La microscopie a extension consiste à aggrandir l'échantillon pour augmenter la résolution.

Microscopie cellulaire :

• multiphotoniques : le fluochrome est exicité avec deux photons. Un des avantages de cette méthode est que l'on obtient un point focal, seul une toute petite zone est illuminée.

Note

En biologie, les longueurs d'onde utilisés pour la multiphotonique sont comprise en 700-1300nm.

• à feuille de lumière (SPIM). La lumière d'excitation est focalisé sur un plan et l'objectif est situé perpendiculairement à ce dernier.

Note

Les caractèristiques de la feuille détermine la qualité de l'image.

Microscopie optique

Pour rappel, la lumière est un phénomène électrique et magnétique et dans un système l'énergie ne peut que diminuer.

Note

Le verre et l'huile ont souvent un n proche.

Polariser filtrer une lumière en fonction de l'angle d'incidence des ondes.

Microscope est un appareil composé :

• D'un objectif qui sert à
• D'un oculaire qui sert à corriger les aberrations.

Les aberrations sont dû au fait que la fréquence des ondes lumineuses a une incidence sur l'angle de réfraction lors d'un changement de milieu. Cela donne lieu au phénomène de diffraction.

Diffraction phénomène d'étalement de la lumière.

Ouverture numérique l'angle d'écart et la quantité de réfraction.

L'indice de réfraction est une mesure l'atténuation de l'onde dans le milieu.

Champs sombre et contraste de phase

Le principe est de modifier la façon dont on éclaire l'échantillon pour visualiser les détails.

Contraste augmenter utilisation de la réfraction différente en fonction de la composition de l'échantillon.

Phase propriété d'addition et de soustraction des longueurs d'onde.

Un anneau lumineux éclaire l'échantillon.

Fonction d'un microscope spectre d'absorbance

Peu fluorescence + exemple critère du choix

Technique micro

Microscopie a fluorescence à champ large

Réponse au problème d'une nombre trop faible d'émission de fluochrome

Eclair et capte la lumière sur une épaisseur de l'échantillons.

Déconvolution pour rendre l'image net. Traitement numérique.

Microscopie confocale

L'échantillon est éclairé de façon graduelle.

Photoblanchiment perte de la faculté d'une molécule à être fluorescente. Elle se produit pour donner suite à l'oxydation.

Utilisé pour suivre la cinétique en créant une zone bleacher comme référence.

Fluorescence

• Luminescence par l'excitation des électrons d'un atome. On parle de fluorescence si le temps de démission d'un nouveau photon est « instantané » et sinon de phosphorescence.
• Incandescence par la chaleur (agitation thermique).
• Électroluminescence par le passage d'un courant d'électrons.
• Radioluminescence.
• Chimiluminescence lorsque le photon est produit au cours d'une réaction chimique (dont la bioluminescence de la luciférase).

De nombreux paramètre influence le rendement et l'efficacité du fluorochrome (polarité, ph, ions, liaison OH, pression, viscosité, T°, inhibiteurs, potentiel électrique).

Polarité un solvant faiblement polaire à tendance à diminuer la longueur d'onde d'émission.

En augmentant la viscosité, on limite la dégradation du fluorochrome.

Fonction d'étalement du point correction informatique.

Confocal illumination de l'échantillon par laser. Précision de la zone éclairée. Modifie la façon dont l'échantillon est éclairé.

Déterminer la bonne dimension d'une image pour limiter la perte de donner lorsqu'il y a une conversion en binaire (enregistrer en format informatique).

L'idée est de

Résolution x grossissement

Résolution maximale au double de celle du système d'acquisition.