Purifier et séparer les protéines
Migration sur gel SDS-Page
La migration permet en plus de créer des échantillons avec des protéines d'une gamme de taille restreinte.
Dénaturation des protéines qui sera utile pour faciliter le découpage en peptides.
Un dosage est une méthode qui permet de calculer la concentration d'un composé dans un échantillon.
- Par la mesure d'absorbance (peu précise)
- La méthode de Bradford (gamme de BSA colorée au bleu de Coomassie)
- Méthode BioCinchoninic acid Assay (BCA)
Isoler une protéine d'intérêt
Un anticorps dirigé vers une des protéines est associé à des billes d'agarose. La solution composée des billes et des enzymes sont centrifugées. Le complexe, plus lourd, se retrouve au fond du tube.
Électrophorèse
Il existe plusieurs types d'électrophorèse :
- En gel de polyacrylamide contenant du dodécysulfate de sodium (PAGE-SDS). Ce dernier sert, avec le pH, à la linéariser les protéines.
- Par focalisation isoélectrique (IEF) sépare par la charge électrique.
L'électrophorèse 2D consiste à réaliser une séparation :
- en fonction du point isoélectrique (IEF) en faisant un gradient de pH sur gel.
- par la taille.
Un tampon de charge Laemmli est ajouté aux protéines pour suivre le front de migration.
Purifier les protéines
Facteur de purification activité spécifique de l'étape par rapport à celle de départ.
Purification de protéines
Activité spécifique activité de la protéine étudiée par rapport à la quantité de protéines présente.
Rendement activité de la protéine de l'étape par rapport à l'activité de départ.
Facteur de purification activité spécifique de l'étape par rapport à celle de départ.
réactions d’oxydoréduction différence de potentiel entre le couple. \(\(\Delta = - n \cdot F \cdot \Delta E\)\) avec :
- \(n\) le nbre d’électrons échangés.
\(\(\Delta G = R \cdot T \cdot \ln{\frac{final}{initial}}+ z \cdot F \cdot E_{membranaire}\)\) avec :
- \(E\) le potentiel entre les compartiements.
- \(z\) la charge de la particule échangée.
Note
les formules d’oxydoréduction et de Nerst se ressemblent car le premier est calculé grâce au deuxième.
Électrophorèse
Il existe plusieurs types d'électrophorèse :
- En gel de polyacrylamide contenant du dodécysulfate de sodium (PAGE SDS) sépare par la taille.
- Par focalisation isoélectrique (IEF) sépare par la charge électrique.
L'électrophorèse 2D consiste à réaliser une séparation :
- en fonction du point isoélectrique (IEF).
- par la taille.