Chromatographie

La chromatographie est un ensemble de méthodes qui permet de séparer les protéines en fonction de leurs propriétés chimiques. Il existe quatre types de chromatographie :

• d'exclusion qui sépare en fonction de la taille et de la forme appelé poids moléculaire en kDa. Elle se fait sur gel.
• d'affinité qui filtre par affinité avec un ligand. Les composés se détachent progressivement (élués). Pour les protéines qui consiste à filtrer par le substrat.
• d'échange d'ions qui sépare en fonction de la charge. Des billes chargées retiennent les molécules par leur charge. Elles sont ensuite éluées progressivement par leur charge.
• Sur couche mince.

Note

Il existe une chromatographie qui utilise des anticorps à la place des ions.

Exclusion

La chromatographie d'exclusion ou chromatographie sur gel

Les molécules passent dans des billes percées. Plus la molécule est grosse plus vite elle sortira tandis que les plus petites mettront beaucoup plus de temps à sortir de la colonne. On a une relation linéaire entre \(\log\) de la taille en fonction du volume élué.

\(v_{mort}\) volume d'élution des plus grosses molécules, celles qui ne peuvent pas entrer dans les billes.

\(K_a\) coefficient de partage : \(K_{a} = \frac{v_{élué} - v_{mort}}{v_{total} - v_{mort}}\).

Echanges d'ions

Les protéines sont mises dans une colonne échangeuse avec des billes qui possèdent une charge opposée à la protéine d'intérêt. Les protéines sont détachées progressivement par plusieurs lavages (le solvant est appelé analyte). Il casse les interactions faibles càd de type :

• Hydrogènes.
• Van Deer Val.

La chromatographie d’échange d’ions

L’idée est de faire adhérer les protéines chargées aux billes puis de les détacher en modifiant le pH jusqu’à atteindre le point isoélectrique de la protéine étudiée.

Les billes sont fabriquées en résine avec un groupement

Charge des billes   -   +

Exemple de groupement   Carboxymethyl   diethylaminoethyl

Chromatographie par affinité

Électrophorèse

Séparer les protéines en fonction de la

Taille (dénaturée)  Charge (non dénaturée)

Gel Papier

Chargé

On dépose les protéines en ligne au milieu d’une feuille de papier et on applique un courant électrique sur les deux extrémités de la feuille. Les protéines se trouveront plus ou moins proche des bornes en fonction de leur charge.

Borne chargée   Anode + Cathode -

Attire les protéines chargées   Anion (chargé -)    Cation (chargé +)

Taille

Pour comparer la taille des protéines, on doit d’abord les dénaturer.

On applique un courant électrique qui va provoquer la migration des protéines. Plus elles seront proches du ? sont petites.

La taille des protéines est déterminée par une gamme étalon.

Western Blot ou buvard de western

Il permet de détecter et d’identifier les protéines et leur concentration. Il faut préalablement dénaturer les protéines.

Séparation : Les protéines sont séparées par taille par électrophorèse.

Transfert : Elles sont ensuite transférées sur un gel en appliquant un courant électrique.

Révélation : On ajoute un anticorps spécifique à la protéine étudiée puis d’un anticorps secondaire capable d’émettre de la lumière en présence d’un substrat.

L’intensité lumineuse permet de connaitre la concentration.

Hydrolyse acide

Méthode pour séparer les acides aminés de la protéine.

On utilise notamment de l’acide chlorhydrique.

Chromatographie

Trois types de chromatographies :

• Sur gel qui consiste à filtrer par la taille.
• D'échange d'ions qui consiste à filtrer par la charge.
• D'affinité qui consiste à filtrer par le substrat.

La chromatographie sur gel ou d'exclusion sur gel

On fait circuler la solution dans une colonne échangeuse contenant des billes poreuses. Les grosses molécules sortiront rapidement tandis que les plus petites mettront beaucoup plus de temps.

La chromatographie d'échange d'ions

L'idée est de faire adhérer les protéines chargées aux billes puis de les détacher en modifiant le pH jusqu'à atteindre le point isoélectrique de la protéine étudiée.

Les billes sont fabriquées en résine avec un groupement

Charge des billes	-	+
Exemple de groupement	Carboxymethyl	diethylaminoethyl

Chromatographie par affinité

Chromatographie

Fractionne l'échantillon de départ

Gradient particulièrement utilisée affinité notamment pour les complexes protéiques.

Propriété physique des molécules

Par ce pourrait servir à identifier une erreur

Baisse pH et solvant.

Haute pression sur appareil ? micro-taille paramètre

75nm taille échantillon

Avantage

Pb : utilisation sels étape d'élimination des sels.

Électrophorèse (taille point isoélectrique)

Poids moléculaires apparent

Deux types de HPLC :

Mobile : polaire (inverse apolaire)

Stationnaire : apolaire (inverse polaire avec la silice)

Molécules sortent en premier : polaire