PCR

Objectif :

• Faire synthétiser une enzyme par un autre organisme pour, par exemple, étudier ses effets.
• Réaliser des copies d'une séquence d'[[ADN]].

Amplification en chaîne par polymérase ACP (ou PCR en anglais)

L'amplification en chaîne polymérase permet de dupliquer un grand nombre de fois des séquences d'ADN ou d'ARN à partir d'une faible quantité. Cela peut servir aussi bien dans les enquêtes criminelles ou pour obtenir le génome de momies ou de mammouths.

Il faut une amorce pour la séquence à amplifier. La méthode consiste à répéter un grand nombre de fois les étapes suivantes :

1. Dénaturer en chauffant. L'ADN est dénaturé en étant soumis à une température de 95°C.
2. Hybridation avec la sonde. Reformation des liaisons d'hydrogène avec une amorce pour chaque brin par une baisse de la température qui correspond à la température de fusion -2°C.
3. Réplication. On ajout l'amorce avec des polymérases et des nucléotides pour que l'élongation est lieu. L'ADN polymérase utilisée est résistante à la chaleur. Elle est issue d'une bactérie vivant dans des sources chaudes. L'élongation a lieu à la température de 72°C et à la vitesse de 1 Kb/min.

Sonde séquence d'ADN courte et complémentaire du monobrin d'intérêt.

Les résultats de la PCR doivent être vérifiés par des contrôles :

• Positif, pas la polymérase.
• Négatif, pas l'ARNm (donc de l'ADNc) de la protéine d'intérêt.

Les résultats de la PCR sont vérifiés par migration sur gel (électrophorèse).

Choix des amorces

Lors du choix des amorces, il est important de vérifier :

• Le repliement de l'ADN générer entre les deux amorces.

• La spécificité avec la séquence. Attention aux amorces qui ont des séquences complémentaires opposés et proches dans des chromosomes.

• Si c'est de l'ADN codant prendre une amorce qui chevauche deux exons pour éviter l'hybridation avec l'ADN génomique.

Démarrage à chaud

La PCR est démarrée à chaud « hot start » permet d'éviter les interactions non spécifiques de l'amorce et limiter la polymérisation avec des associations non spécifiques entre les brins. :

• La Taq est inhibée par un anticorps ce qui permet de préparer les réactifs à température ambiante. Le démarrage à chaud permet de lever l'inhibition de la polymérase en dénaturant l'anticorps.
• Les réactifs sont assemblés dans la glace pour ralentir l'activité enzymatique de la Taq. Le démarrage à chaud permet d'éviter la polymérisation avec des liaisons non spécifiques.

Les paramètres expérimentaux sur lesquels on peut jouer pour optimiser la PCR sont :

• La quantité de \(Mg^{2+}\).
• La température d'hybridation.

PCR analyse jusqu'à l'épuisement du dNTP

La PCR analyse est une technique qui permet d'estimer le nombre de matériel de départ (nombre de séquences initiales). Cela est utile, par exemple, pour connaitre le niveau d'expression d'une protéine.

1. La quantité de nucléotides est fixée au départ.
2. Les cycles sont réalisés jusqu'à épuisement des nucléotides.

Plus il y a de séquences au départ, plus la phase de réplication aura lieu prématurément.

Les paramètres qui agissent sur la température de fusion :

Paramètre	Agit sur	Si le paramètre augmente
Coeff de Chargaff %GC	Le nombre de liaisons hydrogène	Stabilise
pH qui ionise les phosphates	La force de répulsion électrostatique (dénaturant)	Dénature
Concentration en cation, force ionique	Neutralise les charges	Stabilise
L'urée, formamide	Compétiteur des liaisons hydrogène entre bases	Dénature
Concentration en ADN, Activité de l\'eau	Affecte la constante diélectrique	Stabilise
Longueur de la molécule d\'ADN	Nombre de zones riches en GC	Stabilise

Révéler les fragments d'ADN présent

Deux méthodes pour révéler les fragments présents :

• Indirecte. Pour cela, on utilise des agents intercalants qui permettent de quantifier tous les brins hybridés.
• Directe, une séquence particulière est quantifiée. Ce principe utilise des sondes.

Les types de sondes

Les sondes contiennent l'élément fluorescent. Elles sont spécifiques à la séquence d'intérêt. Les principaux types de sondes sont :

• Taqman La fluorescence est inhibée par sa liaison avec la sonde. Lorsque la sonde est appareillée. La polymérase dégrade l'extrémité 5 '-3' et libère le fluorochrome qui devient actif.
• FRET. La méthode utilise deux sondes qui lorsqu'elles sont adjacentes, elles deviennent fluorescentes. Il y a deux fluorochromes. Le premier émet un photon capté par le second. Les spectres d'absorption et d'émission doivent se recouper.
• Balise moléculaire. La sonde adopte un repliement qui inhibe le fluochrome lorsqu'elle n'est pas liée à l'ADN. L'inhibition est alors levée lorsqu'elle s'hybride avec sa séquence complémentaire et le fluorophore devient actif.

Optimiser la PCR

Une attention particulière doit être accordée à :

• La pureté de l'ARN ou ADN. Une contamination peut entrainer forte augmentation du nombre de copies.
• La précision dans le pipetage.