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Pour toutes les expériences, il faut avoir :

  • dans les échantillons tester, il faut un échantillon de référence (ou témoin) qui sert de repère pour comparer les résultats aux autres conditions expérimentales.

  • des étapes de vérifications comme vérifier la présence de ses cellules au microscope ou réaliser des contrôles :

    • Négatif la condition n'est pas présente. Elle ne doit pas être détectée.
    • Positif condition expérimentale certifiée. Sa présence est assurée.

Important, il faut ajouter le plus possible des étapes de vérifications.

Important lorsqu'il y a des composés communs entre plusieurs échantillons, il est préférable de préparer une solution globale qui sera à distribuer dans chaque échantillon pour limiter la variation des conditions expérimentale entre les échantillons.

Réplica biologique plusieurs individus avec dans les mêmes conditions.

Réplica technique plusieurs analyses d'un même échantillon.

Fabrication d'une gamme

Échantillon artificiel constitué une gamme permet de s'assurer que la gamme contiendra la valeur de tous les échantillons.

Noter les noms des échantillons sur les parois et pas sur les couvertes pour éviter les problèmes de sens.

Les techniques utilisées

Les solutions courantes :

  • PBS (tampon phosphate salin) tampons qui a la même osmose que les cellules. Il est composé principalement de ions qui stabilise les biomolécules.
  • SDS il est à la fois un détergent et un dénaturant. Le SDS est fortement négatif et charge les protéines négativement (utilisé notamment pour les électrophorèses).

  • Les alcools :

    • Éthanol, isopropanol pour précipiter les acides nucléiques.
    • Phénol solubilise l'ADN et ARN.

  • Sels favorisent les liaisons d'hydrogène.

  • Intercalant ADN
  • Chloroforme

  • Fixateur. Évite l'autolyse :

    • Formaldéhyde (abrégé en formol). Liaison covalente intra et inter protéines.

  • \(H_2O_2\) inhibition irréversible par une suroxydation du cofacteur (hème \(Fe^2+\)) des peroxydases. Des péroxydases sont utilisées comme cytochrome.

  • Dextran de sulfate formamide molécule qui s'entourent d'eau. Elle augmente la concentration des autres composées notamment leur probabilité de rencontre.
  • Agents chélateurs molécules qui bloquent les ions bivalents.

  • Dénaturant :

    • Guanidinium thiocyanate lyse cellule + dénature

  • Les ADN précipitent à pH acide ou faire une extraction phénol/chloroforme.

  • Osmium fixateur de lipides et de protéines. Métaux contient de nombreux électrons.
  • Agent intercalant de l'ADN et de l'ARN iodure de propidium.
  • Mercaptoéthanol réduit les ponts disulfures.

Vocabulaire

Ne pas utiliser le terme tache. On parlera de bande ou de spot.

Dialyse technique consistant à diminuer la concentration de molécules en créant un gradient chimique.

Chromatographie ensemble de méthodes qui permet la séparation de composants chimiques.

Lyophiliser méthode qui consiste à retirer l'eau d'un produit en le congelant puis en faisant évaporer la glace par une baisse de la pression.

Condition non dénaturante condition qui conserve les liaisons non covalentes notamment les complexes protéiques.

Type de mutations :

  • Mutation perte de fonction : mutation qui conduit à l'absence de production de l'ARN.

Technique d'étude de séparation moléculaires :

  • Électrophorèse :
  • SDS-PAGE
  • Chromatographie :

Techniques d'étude des protéines :

Technique Objectif et principe
Chromatographie Ensemble de techniques ayant pour but de séparer les composées.
Immunoprécipitation Montrer que deux protéines s'associent.
Western blot vérifier la présence des deux protéines.
# Méthodes d'étude du rôle d'un type cellulaire

Pour déterminer le rôle d'un type cellulaire, on détruit le type cellulaire étudié. Il existe deux méthodes, l'utilisation :

  • D'animaux dont l'expression des gènes qui fabriquent le type cellulaire étudié est bloqué.

  • La filtration par l'utilisation d'antigènes qui ciblent des récepteurs membranaires spécifiques de la cellule étudiée. Cette méthode peut être réalisé soit :

    • À l'intérieur de l'organisme. La fixation des anticorps qui conduit à la mort cellulaire.
    • À l'extérieur de l'organisme. Les cellules sont filtrées par exemple par l'ajout d'aimant aux anticorps.

PFU méthode pour mesurer la quantité de molécules virales. Lors d'expériences, les quantités virales utilisées sont définies autour de celles qui conduit à un taux de mortalité de 50%.

Les principales méthodes

  • Blot détection d'une protéines ou d'un polymère d'acide nucléique spécifique.
  • Chromatographie méthode de séparation.
  • Électrophorèse séparation par le poids moléculaire (taille des chaines dépliées).

Warning

L'électrophorèse la distance de migration dépend de la quantité d\'ADN ou de protéines sur le gel. Si les quantités entre la gamme étalon et l\'échantillon sont trop importantes.

Quantification des protéines

Il existe plusieurs méthodes [[biologie/méthodes/protéines/étude des protéines]] mon quantifié l'ADN :

  • L'électrophorèse
  • La [[MS spectrométrie de masse]].

Limite de l'électrophorèse (visualiser modification post traductionnelle) pas très reproductible.

Quelques avantages de la spectrométrie de masse :

  • Certaines coloration sont compatibles avec spectrométrie notamment Coomassie.