Etude des protéines
- [[MS spectrométrie de masse]]
- western [[blot]]
Pharmacothérapie domaine d'étude les interactions moléculaires.
Dénaturation perte de la conformation initiale d'une molécule biologique. Les protéines dénaturées perdent souvent leur fonction.
Dialyse méthode de purification.
Méthodes pour sélectionner les protéines à étudier :
- [[chromatographie]]
- Gel-filtration
- Électrophorèse
Etude des protéines avec la lumière :
- dichroïsme circulaire
Les aa et leur absorption :
- 250-270 nm → phenylalanine (F)
- 270-290 nm → tyrosine (Y)
- 280-300 nm → tryptophane (W)
Les interactions par [[calorimetrie]]
Chromatographie
Trois types de chromatographies :
- sur gel qui consiste à filtrer par la taille.
- d’échange d’ions qui consiste à filtrer par la charge.
-
d’affinité qui consiste à filtrer par le substrat :
- Biotine (vitamine B8) avec le strept.
- Du nickel avec l'histidine.
- Hydrophobe avec des chaines carbonées. De grande taille pour les petites molécules et petite avec les grandes molécules pour
- grandes molécules non polaire avec de petites chaines carbonées (sinon les molécules restent collées).
Dénaturation des protéines
La dénaturation pour les protéines consiste notamment à briser les liaisons disulfures (cystéine).
La dénaturation peut être effectuée en :
- Modifiant le pH (hydrolyse acide). On utilise notamment de l'acide chlorhydrique.
- Augmentant la température.
Note
La modification du pH aura pour conséquence de modifier les charges des aa chargés mais pas celles du cœur apolaire de l'enzyme.
Dichoïsme circulaire
Etude de la structure :
- secondaire entre 180 et 240 nm.
- tertiaire entre 250 et 320 nm.
Structure secondaire
Le princiep est d'envoyer de la lumière polarisé entre 180 et 240 nm sur la rpotéine et de mesurer la transformation de la lumière transmise. L'intensité dépend des structrures secondaires :
- Hélice \(\alpha\) décroissant avec deux minimums à 210 et 220nm.
- Feuillet \(\beta\) positif décroissant avec un minimum 195nm.
- Aléatoire croissant négatif.
Structure tertiaire
L'étude de la structure tertiaire se fait par la fluorescence démise par les noyaux aromatiques (F phenylalanine, Y tyrosine, W tryptophane) qui dépend de l'état de transitions vibrationnelles.
Note
Les aa aromatiques sont rigides grâce aux cycles aromatiques ce qui augmente l'intensité de la fluorescence.
La longueur d'onde d'émission donne une information :
- sur l'environnement :
* Blue shift vers des conditions plus apolaire. * Red shift vers des conditions plus apolaire.
- L'intensité sur les contraintes exercées sur le fluophore. Plus elles sont importantes càd plus l'intensité est importante car l'énergie ne peut pas être dissiper par du mouvement.
| Aa | Longueur d'onde d'exicitation (nm) | Longueur d'onde d'émission (nm) |
|---|---|---|
| Tryptophane (W) | 295 | 330 (apolaire) - 360 (polaire) |
| Tyrosine (Y) | 280 | 300 (apolaire) - 330 (polaire) |
| W + Y | 280 | |
| ### Western Blot |
ou buvard de western
Il permet de détecter et d’identifier les protéines et leur concentration. Il faut préalablement dénaturer les protéines.
Séparation : Les protéines sont séparées par taille par électrophorèse.
Transfert : Elles sont ensuite transférées sur un gel en appliquant un courant électrique.
Révélation : On ajoute un anticorps spécifique à la protéine étudiée puis d’un anticorps secondaire capable d’émettre de la lumière en présence d’un substrat.